ردکردن این

روش های استخراج DNA

معرفی روش های استخراج DNA:

تکنیک‌هایی که برای استخراج DNA استفاده می‌شوند بسته به نوع نمونه، اندازه و زمان نمونه گیری متفاوت هستند(1). علیرغم تنوع زیاد روش‌های استخراج DNA، می­توان به وجود اشتراکاتی بین این روشها مانند جدا کردنDNA  از سایر اجزای سلولی اشاره کرد(1). DNA هر فرد می‌تواند از تمام نمونه‌های بیولوژیکی مانند بافت‌های زنده و یا فیکس شده، خون، بزاق و یا مدفوع استخراج شود(2).

لازم به ذکر است که استخراج DNA باید به ملایم‌ترین شیوه ممکن صورت بگیرد تا از آسیب به DNA و شکستن آن به قطعات کوچکتر جلوگیری شود(3). استخراج DNA معمولا با از هم گسستن نمونه بافتی و لیز سلول‌ها آغاز می‌شود و به این منظور غشای سلولی باید تخریب گردد. در طول این فرایند، تخریب ساختارهای پروتئینی و نیز آزاد کردن اسیدهای نوکلئیک از هسته ضروری می­باشد(4,5).

در حالت کلی لیز نمونه مورد نظر، در محلول نمکی حاوی دترجنت‌[1] و پروتئازها انجام شده و این کار موجب از هم گسستن ساختارهای سلولی و حل شدن غشا می‌شود(6). پس از آزاد شدن ترکیبات داخل سلولی، باید آن‌ها را از بقایای غشای سلولی توسط سانتریفیوژ جدا کرد و در ادامه با استفاده از استخراج شیمیایی، DNA را خالص سازی کرد(7).

در ادامه با انجام سانتریفیوژ، باعث جداسازی ذرات بر اساس اندازه‌ می‌شود، زیرا مولکول‌های بزرگتر و سنگین‌تر زودتر از مولکول‌های کوچکتر ته­نشین می‌شوند. به علاوه موادی که در فاز آبی نامحلول هستند، لخته‌هایی را تشکیل می‌دهند که سریع‌تر در کف لوله سانتریفیوژ ته‌نشین می­شوند (شکل1).

شکل1– تصویر شماتیک از مراحل سانتریفوژ بقایای سلولی حین استخراج DNA

عصاره سلولی علاوه برDNA ، حاوی مقادیر زیادی RNA و پروتئین است. در ادامه فرآیند استخراج، برای جداسازی اجزای سلولی از DNA، از انواع روش های استخراج شیمیایی مانند استخراج با فنول می­توان استفاده کرد(6).

فنول ماده ای با خاصیت اسیدی است که می‌تواند ۶۰ تا ۷۰ درصد مولکول‌های زیستی از جمله پروتئین‌ها را از بین ببرد. فنول حلالیت پایینی در آب دارد و پس از مخلوط شدن با نمونه آبی حاوی DNA و پروتئین، دو فاز جدا از هم را تشکیل می­دهد(8). پروتئین در لایه فنولی و نوکلئیک‌اسید در لایه آبی قرار می‌گیرد. سپس دو لایه توسط سانتریفیوژ از یکدیگر جدا شده و به این ترتیب DNA موجود در لایه آبی از پروتئین­ها جدا می‌شود(6,8).

پس از جدا شدن مولکول‌های DNA از پروتئین‌ها، نمونه هنوز دارای هر دو نوع نوکلئیک‌اسید RNA و DNA است. از آن‌جایی که RNA نیز یک نوکلئیک اسید است، در فنول محلول نیست. بنابراین برای از بین بردن RNA از آنزیمی به نام ریبونوکلئاز[1] استفاده می­شود(9).

در مرحله آخر، در صورت افزودن حجم یکسانی از ایزوپروپانول مطلق، قطعه بزرگ DNA موجود در فاز آبی، به صورت کلاف رشته ای سفید رنگ جدا شده و توسط سانتریفیوژ استخراج شده و در بافر دلخواه که در بسیاری از موارد آب مقطر است، حل می­شود(10,11).

DNA بدست آمده می‌تواند در آزمایشات مختلف از جمله تست­های ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرد(12)


 

[1] Detergent

[2] Ribonuclease

منابع:

  1. Ng DPK, Koh D, Choo S, Chia KS. Saliva as a viable alternative source of human genomic DNA in genetic epidemiology. Clin Chim Acta. 2006 May;367(1–2):81–5. 
  2. Ali SM, Mahnaz S, Mahmood T. Rapid genomic DNA extraction (RGDE). Forensic Sci Int Genet Suppl Ser. 2008 Aug;1(1):63–5.
  3. Quinque D, Kittler R, Kayser M, Stoneking M, Nasidze I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Anal Biochem. 2006 Jun 15;353(2):272–7.
  4. Mackenzie BW, Waite DW, Taylor MW. Evaluating variation in human gut microbiota profiles due to DNA extraction method and inter-subject differences. Front Microbiol. 2015;6(FEB).
  5. Ghatak S, Muthukumaran RB, Nachimuthu SK. A simple method of genomic DNA extraction from human samples for PCR-RFLP analysis. J Biomol Tech. 2013 Dec;24(4):224–31.
  6. Healey A, Furtado A, Cooper T, Henry RJ. Protocol: A simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 2014 Jun 27;10(1).
  7. Smith AK, Kilaru V, Klengel T, Mercer KB, Bradley B, Conneely KN, et al. DNA extracted from saliva for methylation studies of psychiatric traits: Evidence tissue specificity and relatedness to brain. Am J Med Genet Part B Neuropsychiatr Genet. 2015 Jan 1;168(1):36–44.
  8. Demeke T, Jenkins GR. Influence of DNA extraction methods, PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of biotechnology-derived traits. Vol. 396, Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2010. p. 1977–90.
  9. Agüero-Chapín G, González-Díaz H, De La Riva G, Rodríguez E, Sánchez-Rodríguez A, Podda G, et al. MMM-QSAR recognition of ribonucleases without alignment: Comparison with an HMM model and isolation from Schizosaccharomyces pombe, prediction, and experimental assay of a new sequence. J Chem Inf Model. 2008 Feb;48(2):434–48.
  10. Fregel R, González A, Cabrera VM. Improved ethanol precipitation of DNA. Electrophoresis. 2010 Apr;31(8):1350–2.
  11. Green MR, Sambrook J. Precipitation of DNA with ethanol. Cold Spring Harb Protoc. 2016 Dec 1;2016(12):1116–20.
  12. DNA Fingerprinting: Approaches and Applications – G. Dolf – Google Books [Internet]. [cited 2019 Oct 8].